Questo saggio determina se è avvenuto il legame tra una sequenza di DNA e una proteina. Si basa sul fatto che il DNA a cui sono legate le proteine migra più lentamente in elettroforesi su gel di poliacrilamide non denaturante. Si può incubare il DNA sia con estratti nucleari che con proteine purificate. Nel primo caso si devono caratterizzare le proteine legate tramite anticorpi.
Vantaggi: metodica veloce, semplice, sensibile. Si usano basse quantità di proteina. Il frammento può essere di solo 20 o 30 basi e quindi potrebbe essere ordinarto come primer. Alcune ditte dovrebbero fornire tale primer già marcato radioattivamente.
Svantaggi: il binding DNA-proteina avviene in vitro, fattori quali la concentrazione ionica e il pH possono modificare il binding. Si lavora con il radioattivo.
PROTOCOLLO 1 |
PROTOCOLLO 2 |
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| Generare il frammento di DNA marcato radioativamente (dATP con fosforo 32) tramite PCR. Questo conterrà al centro la sequenza presunta di bind con il fattore di trascrizione. E' conveniente utilizzare un primer marcato con T4 polinucleotide chinasi. Purificare gli amplificati di PCR mediante elettroforesi. Generare un altro frammento che non contenga il sito di binding, da usare come controllo negativo. |
Comperare il frammento di DNA già marcato e della sequenza desiderata. 0.5 ng 10000 c.p.m. |
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Nel caso di binding con proteina purificata, è necessaria una quantità di proteina che va da 5 a 25 ng.
Nel caso di binding con estratto nucleare ogni reazione contiene 2 µg di estratto nucleare, 0.5 µg poly(dI-dC) e 10000 c.p.m. di DNA marcato per essere analizzato in 20 µl di buffer contenente 20 mM HEPES pH 7.9, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 3 mM MgCl2, 5% glycerol.
Incubare per 20 minuti con ghiaccio.
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Reazione di binding del volume di 25 µl contenente 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, 5% glicerolo, 8 µg di proteina. Fare diverse incubazioni in presenza e in assenza di DNA competitore (poly(dI-dC) da 200 ng a 3000ng).
Incubare 30 minuti a temperatura ambiente. |
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| La reazione di binding viene analizzata mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide al 4%
(19:1 bis acrylamide) in 0.25X di buffer TBE a 5 V/cm per 4-6 h a 4°C. |
La reazione di binding viene analizzata mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide al 4%
(30:1 bis acrylamide) contenente 6.7 mM Tris-HCl pH 7.5, 3.3 mM sodio acetato, 1 mM sodio EDTA. Far correre il gel per 30 minuti a 11 V/cm. Inserire i campioni nel gel e far correre per 90 minuti a temperatura ambiente con ricircolazione del buffer. |
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| Asciugare il gel e autoradiografare. |
Asciugare il gel e autoradiografare a -70°C. |
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Riferimenti:
Androgen receptor-associated protein complex binds upstream of the androgen-responsive elements in the promoters of human prostate-specific antigen and kallikrein 2 genes
Zijie Sun, Jing Pan, Steven P. Balk
Nucleic Acids Research, Vol 25, Num 16, Pg 3318-3325
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Riferimenti:
A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes.
Singh, Sen, Baltimore, Sharp.
NATURE vol 319, 9 Gennaio 1986, pg154-158 |
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